张进课题组揭示rRNA生物发生调控小鼠ES2Clike细胞命运转变机制

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该研究是张进课题组在2021年7月31日Protein & Cell杂志上发表的题为“LIN28 Coordinately Promotes Nucleolar/Ribosomal Functions and Represses the 2C-like Transcriptional Program in Pluripotent Stem Cells”的研究论文的进一步拓展。这两项研究与张进课题组近期关于胚胎代谢（Nature Metabolism, 2021) 和细胞周期对2CLC的影响（Stem Cell Report, 2021) 的研究共同探索了传统被认为具有持家基因 (housekeeping gene) 功能的核仁、代谢等，在早期胚胎发育和细胞命运转变中的特异作用。

小鼠二细胞 (2C) 阶段胚胎细胞是胚胎发育早期阶段的全能性干细胞，可以产生胚胎和胚胎外组织的所有细胞类型。在体外培养的小鼠胚胎干细胞 (ES) 中，存在一小群分子特征与2C期胚胎的分子特征相似的2C-like细胞。

最近研究表明，ES细胞向2C-like细胞的转变受到与表观遗传修饰相关的多种因素的调控[1,2,3]。染色质高级结构是重要的表观遗传因素，与基因表达调控和细胞命运转变密切相关。有趣的是，染色质高级结构似乎是2C基因调控和ES细胞向2C-like细胞转变的重要因素。例如，2C基因激活受到先驱转录因子Dux的调节，该因子可增加染色质可及性。

最近的两项研究报道称，多能性因子DAPP2和DAPP4以及母源性因子NELFA可以与Dux的启动子区域结合并直接反式激活其表达[4,5]。此外，染色质结构重塑因子CAF-1的下调可以诱导ES细胞向2C-like细胞转变[6]。此前的研究表明定位于核仁的蛋白NCL,LIN28可以与TRIM28(KAP1)相互作用调控2C基因的表达[7,8]。然而，我们尚不完全了解核仁周边异染色质以及其高级结构如何调控ES细胞2C-like细胞转变。

图1. rRNA生物合成抑制剂CX-5461处理激活2C基因

首先，我们发现rRNA合成抑制剂CX-5461处理ES细胞引起2C基因的高表达（图1）。rRNA生物发生在核仁相分离中发挥关键作用，我们进一步检测了CX-5461处理前后核仁相分离的变化情况，发现CX-5461处理影响了核仁正常相分离，关键蛋白NCL、NPM1以及RPA194介导的相分离液滴流动性明显增加，NCL和NPM1在核仁DFC层中形成的独特环形结构消失（图2）。

图2. rRNA生物合成抑制剂CX-5461影响了核仁正常相分离

相分离能够对染色质表观遗传状态进行调控，利用ChIP-seq和ATAC-seq测序实验，本研究进一步检查了CX-5461处理前后，核仁周边异染色质表观遗传状态的变化，发现CX-5461处理后，活跃性的表观修饰H3K4me3和H3K27ac水平明显增加，抑制性的表观修饰H3K9me3和H3K27me3水平明显降低（图3）。NCL/TRIM28复合物是ES细胞中维持核仁异染色质区的关键蛋白，NCL在核仁DFC层中形成的独特环形结构消失，提示我们CX-5461处理解除了NCL/TRIM28复合物对核仁异染色质区的结合。

本研究进一步发现，CX-5461处理后，NCL/TRIM28复合物对核仁异染色质区的结合明显降低。

图3. rRNA生物合成抑制剂CX-5461干扰了核仁异染色质区的表观遗传状态

通过结合公开发表ChIP-seq、ATAC-seq、RNA-seq测序数据以及qPCR和ATAC-seq测序实验，本研究进一步研究发现rRNA生物合成抑制是通过关键转录因子DUX蛋白来激活2C基因（图4）。

图4.DUX调控CX-5461处理诱导的2C基因激活

核仁异染色质区表观遗传状态的变化提示我们其染色质高级结构发生了变化，本研究进一步利用Hi-C测序技术解析了CX-5461处理前后ES细胞染色质高级结构的变化情况，发现CX-5461处理后，ES细胞核仁异染色质区和MERVL区域的3D基因组高级结构与2C胚胎更为相似（图5）。

图5.CX-5461处理导致MERVL区域的3D高级结构与2C胚胎更为相似

在此基础上，本研究进一步通过细胞遗传学手段干扰rRNA生物合成，发现干扰rRNA生物合成过程中的步骤可以重现了CX-5461处理后的ES细胞分子表型（图6）。

图6. 细胞遗传学手段干扰rRNA生物合成重现了CX-5461处理后的ES细胞分子表型

最后，本研究利用CX-5461在小鼠早期胚胎上进行了实验，重现了ES细胞中的分子表型，有趣的是，研究发现rRNA生物合成是调控二细胞胚胎向四细胞胚胎转变的关键调控因素（图7）。

图7. rRNA生物合成是调控二细胞胚胎向四细胞胚胎转变关键因素，CX-5461处理小鼠胚胎重现ES细胞中的分子表型

综上所述，本研究首次发现了rRNA 介导的核仁相分离和核仁周边异染色质的高级染色质结构能够调控ES细胞向2C-like细胞的命运转变；同时发现了rRNA生物发生是调控小鼠二细胞胚胎到四细胞胚胎转变的关键分子开关。本研究提供了一种将ES细胞重编程回2C-like细胞的潜在新方法，并加深了我们对干细胞命运决定和早期发育中核仁功能的理解。

实验室简介

张进课题组长期从事干细胞命运调控方面的研究，实验室成立以来作为通讯作者在Nature Metabolism, Cell Metabolism, Cell Stem Cell, Nature Communications, Protein & Cell, Journal of Hematology & Oncology, Genome Biology, Molecular Therapy, Stem Cell Report 等杂志发表文章十余篇。实验室目前的研究方向包括早期胚胎发育和干细胞命运转变的调控机制，以及iPSC分化免疫细胞的转化研究。

详细信息请见实验室网站https://person.zju.edu.cn/zhangstemcell。

参考文献

[1] Macfarlan, T. S. et al. Embryonic stem cell potency fluctuates with endogenous retrovirus activity. Nature 487, 57–63 (2012).

[2] Matsui, T. et al. Proviral silencing in embryonic stem cells requires the histone methyltransferase ESET. Nature 464, 927–931 (2010).

[3] Rowe, H. M. et al. KAP1 controls endogenous retroviruses in embryonic stem cells. Nature 463, 237–240 (2010).

[4] Eckersley-Maslin, M. & Alda-Catalinas, C. Dppa2 and Dppa4 directly regulate the Dux-driven zygotic transcriptional program. Gene Dev. 33, 194–208(2019).

[5] 17. Hu, Z. & Tan, D. E. K. Maternal factor NELFA drives a 2C-like state in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 22, 175–186 (2020).

[6] Ishiuchi, T. et al. Early embryonic-like cells are induced by downregulating replication-dependent chromatin assembly. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 662–671(2015).

[7] Percharde, M. et al. A LINE1-nucleolin partnership regulates early development and ESC identity. Cell 174, 391–405 (2018).

[8] Zhen Sun, Jin Zhang. et al. LIN28 coordinately promotes nucleolar/ribosomal functions and represses the 2C-like transcriptional program in pluripotent stem cells. Protein & Cell (2021).